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1. Tesis de Maestría y Doctorado >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1834/3424

Title: Identificación, caracterización y herencia de microsatélites y su aplicación como marcadores moleculares en un programa de mejoramiento de camarón blanco
Authors: Cruz, P.
Theses advisor: Mejía, C.H.
Pérez, R.
ASFA Terms: Genetics
Aquatic animals
Issue Date: 2003
Abstract: Enmarcado dentro de un programa de mejoramiento genético de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) y con fines de evaluar la variabilidad genética dentro de dicho programa, se identificaron marcadores moleculares tipo microsatélites, abarcando desde su secuenciación, caracterización, diseño de iniciadores, optimización del PCR y análisis de ajuste a una herencia mendeliana. Para caracterizar a los microsatélites se construyó una genoteca parcial Sau3A1 con aproximadamente 2000 clonas. Para identificar a los microsatélites se siguieron dos estrategias: A) secuenciado directo de clonas y B) secuenciado de clonas que hibridaran positivamente con dos sondas biotiniladas (CT)10 y (GT)10. Los microsatélites identificados fueron principalmente dinucleótidos, 58.82 % (1/0.42 kb), seguidos de trinucleótidos, 27.73 % (1/0.88 kb), tetranucleótidos, 9.25 % (1/2.7 kb), y pentanucleótidos, 4.2 % (1/5.84 kb). El microsatélite (CT)n fue el mas abundante seguido de (GT)n, coincidiendo con un reporte previo para esta misma especie, a pesar de que en Penaeus monodon, y en la mayoría de los artrópodos y vertebrados, el dinucleótido (GT)n es el mas abundante. La elevada presencia de una región previamente reportada de un satelite/microsatélite (PVS1) en las clonas (43.33 %), y por ende en el genoma de L. vannamei (1/0.8 kb) disminuyó la probabilidad de identificar nuevas regiones microsatélites, por lo que se propone conformar librerías de DNA genómico cortando con enzimas de restricción (ej. HaeIII, AluI, o HincII, vector SmaI) que no reconozcan tal región. Después de secuenciar 90 clonas (29,199 pb), e identificar 119 regiones microsatélites en 56 de éstas, con una abundancia de microsatélites de 1 cada 0.25 kb, se evaluaron 25 pares de iniciadores diseñados en las zonas flanqueantes de los microsatélites para amplificarlos mediante la “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR). Siete fueron los microsatélites amplificados, de los cuales cinco presentaron claros patrones de bandeo. Los cinco microsatélites amplificados exitosamente por PCR tienen un elevado potencial para la evaluación de variabilidad genética en poblaciones naturales de L. vannamei. De los dos microsatélites más polimórficos (Pvan1758 y Pvan1815) se optimizó la reacción de PCR hasta interpretar correctamente sus diferentes variantes alélicas y genotipos individuales. Ambos loci-microsatélites analizados (Pvan1758 y Pvan1815) se ajustaron a una herencia mendeliana, al evaluar su segregación alélica en la progenie de tres familias, corroborando con el genotipo materno y logrando inferir el genotipo paterno. En el locus Pvan1815, se observaron alelos nulos, lo cual se resolvió al manejar condiciones menos astringentes en el PCR (mayor concentración de MgCl2). Lo anterior aumentó la confiabilidad de estos microsatélites para su posterior aplicación. Los microsatélites Pvan1758 y Pvan1815 se usaron para evaluar la variabilidad genética a lo largo de tres generaciones de camarón cultivado siguiendo una estructura familiar. A partir de organismos de una línea domesticada de Los Melagos Son.-Venezuela (MV) (G0 o población fundadora) se produjeron dos generaciones consecutivas (G1 y G2) de camarón blanco. El propósito de este estudio fue monitorear la variabilidad genética desde la población fundadora hasta la segunda generación, para establecer si los niveles de variabilidad eran los adecuados para proseguir con un programa de selección a largo plazo. La variabilidad genética evaluada en términos de heterocigosidad, tanto observada (Ho) como esperada (He) no cambió significativamente a lo largo de las generaciones (Ho = 0.65 - 0.72; He = 0.77 - 0.71) situándose alrededor del valor observado (Ho) promedio reportado para especies silvestres (0.666) y por arriba del reportado en especies cultivadas (0.594). La variabilidad genética evaluada en número de alelos (nA) mostró un ligero aumento debido a la ganancia de alelos raros, en tanto que en el número de alelos efectivos (ne) se observó una reducción del 16.6 % de G0 a G2. El número de alelos (nA = 7.5 – 10) y el número efectivo de alelos (ne = 4.16 – 3.47) se situó por debajo de lo observado en poblaciones silvestres pero por arriba de lo reportado en poblaciones cultivadas. Se observaron diferencias en frecuencias alélicas en generaciones consecutivas en uno (G0-G1) o ambos loci (G1-G2), debido al aumento y disminución de ciertas variantes alélicas, lo cual puede ser atribuido a la contribución de los machos MV, que en la G0 no fue incluida en el análisis y en la G2 representó una nueva introducción de variabilidad. A pesar de unos niveles de variabilidad genética aceptables en términos de heterocigosidad, los cambios en el número de alelos efectivos (ne) muestran una tendencia previa a permanecer 3 a 4 alelos en ambos loci, lo cual parece indicar que la población fundadora MV ya mostraba una reducción de variabilidad genética, la cual puede ser corregida durante las etapas tempranas del programa de crianza al introducir nuevos organismos con variabilidad genética diferente. Para incrementar la variabilidad genética en G3, varios individuos del programa fueron apareados con reproductores de una línea colombiana. Un análisis preliminar de los reproductores colombianos (n = 23) reveló valores superiores de variabilidad (nA = 10, ne = 6.85, Ho = 0.74, He = 0.87), diferentes frecuencias alélicas, y dos alelos exclusivos en ambos microsatélites que permitirá distinguir entre líneas. El monitoreo de la variabilidad genética demostró ser útil y deberá continuar en este y otros programas, especialmente antes y después de que la selección sea aplicada. La inclusión de otros marcadores genéticos será útil, no solamente para complementar las evaluaciones de variabilidad genética, sino también para el seguimiento de pedigríes y posible asociación con características importantes a nivel de producción (QTLs).
As an integral part of a genetic breeding program of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) the genetic variability was evaluated with molecular markers, specifically microsatellites identified de novo, including their characterization, sequencing, primers design, PCR optimization, and agreement to Mendelian inheritance expectations. A Sau3A1 partial genomic library with 2000 clones was produced. Two strategies were followed to identify microsatellites: A) direct sequencing of clones, and B) sequencing of positive clones to biotinylated probes (CT)10 and (GT)10. The most abundant identified microsatellites were dinucleotides, 58.82 % (1/0.042 kb), followed by trinucleotides, 27.73 % (1/0.88 kb), tetranucleotides, 9.25 % (1/2.7 kb), and pentanucleotides, 4.2 % (1/5.84 kb). The most abundant microsatellite was (CT)n followed by (GT)n, in agreement with a previous report in L. vannamei and contrasting with Penaeus monodon and most of the arthropods species where (GT)n is the most abundant dinucleotide. There was a previously reported satellite/microsatellite region (PVS1) in 43.33 % of the clones, resulting in a high abundance in the L. vannamei genome (1/0.8 kb). Because the presence of this microsatellite in the shrimp genome reduces the possibility of finding new microsatellites, we propose the construction of libraries by cutting with restriction enzymes that do not recognize any sequence in the PVS1 region (i.e. HaeIII, AluI, or HincII, vector SmaI). After sequencing 90 clones (29,199 bp), and identifying 119 microsatellite regions in 56 clones, an abundance of one microsatellite per 0.25 kb, the amplification by PCR of 25 designed primers pairs was evaluated. Seven microsatellites were amplified, and the banding pattern was clearly interpreted in five of them. These microsatellites have a high potential in genetic variation studies of populations of L. vannamei. The PCR amplification of the most polymorphic microsatellites (Pvan1758 y Pvan1815) was optimized to identify alleles and genotypes. Both microsatellites agreed with Mendelian expectations when the offsprings of three families were evaluated. The maternal genotype was verified and the paternal was inferred. The locus Pvan1815 showed null alleles, which were resolved decreasing the stringency of the PCR reaction increasing MgCl2 concentration. These analyses and modifications increased the confidence in the use of these microsatellites in genetic variation studies. Genetic diversity in a shrimp-breeding program with an established pedigree was monitored for three generations by Pvan1578 and Pvan1815 microsatellites. Two consecutive generations were produced (G1 and G2) using as a founder stock (G0) a captive population in domestication from Los Melagos, Son.- Venezuela (MV line). The main goal was to monitor these generations to establish levels of genetic variation and proceed with a selection program. The amount of genetic variation, expressed as observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) did not change significantly through generations (Ho = 0.65 - 0.72; He = 0.77 - 0.71) with an average Ho around that reported for wild stocks (0.666) and higher than that observed in cultured stocks (0.594). The genetic variation expressed in number of alleles (nA) increased through the gain of rare alleles. Nevertheless, the mean number of effective alleles (ne) decreased 16.6% from G0 to G2. The average number of alleles at G0 and G2 (7.5 and 10), and the average number of effective alleles (4.16 and 3.47) were less variable than those from wild populations, but higher than those from inbred stocks. There were significant differences in allele frequencies in one (G0-G1) or both (G1-G2) microsatellites, caused by a significant frequency increase or decrease of certain alleles through the contribution of the newly introduced MV male breeders. The MV male variability was not included in G0 but was already considered at the G2 as a new introduction of variability. In spite of the acceptable genetic variation in heterozygosity, the decreased effective number of alleles (ne) through generations highlights the previous trend of 3-4 alleles at both loci to dominate. These reduced ne might indicate that a certain reduction in variability already existed in the initial MV line used as broodstock, which could be corrected during this early stages of the breeding program by introducing new and different organisms. To increase the genetic variation at a G3, several individuals in the breeding program were mated with breeders from a Colombia line. A preliminary analysis of the Colombian breeders (n = 23) revealed higher values of variability (nA = 10, ne = 6.85, Ho = 0.74, He = 0.87), different allele frequencies, and two exclusive alleles in both microsatellites that allow the distinction between the lines. The monitoring of genetic variability has proved useful and should be maintained in this and other breeding programs, especially before and after selection is applied. The inclusion of other genetic markers will be useful, not only to complement the evaluations of genetic variability, but also for pedigree assessments and possible association with productive traits.
URI: http://hdl.handle.net/1834/3424
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